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當前位置： 主頁> 新聞中心> 行業資訊> 酶聯免疫吸附試驗相關知識
一、ELISA的基本原理 ELISA（Enzyme-Linkedimmunosorbent assay）的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。這一方法的基本原理是：①使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活力。在測定時，把待測樣本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開，最后結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化變為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，所以可根據顏色反應的深淺定性或定量分析。由于酶的催化速率很高，所以可極大地放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。 二、ELISA的類型 ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑：①固相的抗原或抗體，即“免疫吸附劑”（immunosorbent） ;②酶標記的抗原或抗體，稱為“結合物（conjugate）;③酶反應的底物。 根據試劑的來源和標本的情況以及檢測的具體條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。用于檢驗的ELISA主要有以下幾種類型： 1．雙抗體夾心法測抗原 雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下圖所示： （1）將特異性抗體與固相載體聯結，形成固相抗體洗滌除去未結合的抗體及雜質。 （2）加待測樣本，溫育反應樣本中的抗原與固相抗體結合，形成固相抗原抗體復合物。洗滌除去其他未結合物質。 （3）加酶標抗體，保溫反應固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與樣本中待測抗原的量相關。 （4）加底物顯色固相上的酶催化底物成為有色產物。通過比色，測得樣本中抗原的量。在檢驗中，此法適用于檢驗各種蛋白質等大分子抗原。只要獲得針對待測抗原的特異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結合物而建立此法。如抗體的來源為抗血清，包被和酶標用的抗體最好分別取自不同種屬的動物。如應用單克隆抗體，一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗，分別用于包被固相載體和制備酶結合物。這種雙位點夾心法具有很高的特異性，而且可以將待測樣本和酶標抗體一起保溫反應，作一步檢測。 2．雙抗原夾心法測抗體 反應模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進行包被和制備酶結合物，以檢測相應的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體。此法中待測樣本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法。本法關鍵在于酶標抗原的制備，應根據抗原結構的不同，尋找合適的標記方法。 3．間接法測抗體 間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標記的抗抗體(抗人免疫球蛋白抗體)以檢測與固相抗原結合的受檢抗體，所以稱為間接法，如下圖所示。操作步驟如下： 片 （1）將特異性抗原與固相載體聯結，形成固相抗原洗滌除去未結合的抗原及雜質。 （2）加稀釋的待測血清，溫育反應血清中的特異抗體與固相抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體，血清中的其他成分在洗滌過程中被洗去。 （3）加酶標抗體可用酶標抗人IgG以檢測總抗體，但一般多用酶標抗人IgG檢測IgG抗體。固相免疫復合物中的抗體與酶標抗抗體結合，從而間接地標記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量與樣本中待測抗體的量相關。 （4）加底物顯色間接法的優點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。間接法成功的關鍵在于抗原的純度。雖然有時用粗提抗原包被也能取得實際有效的結果，但應盡可能予以純化，以提高試驗的特異性。間接法中一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性。血清中待測的特異性IgG只占總IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強，非特異IgG可直接吸附到固相載體上，有時也可吸附到包被抗原的表面。因此在間接法中，抗原包被后一般用無關蛋白質（例如，牛血清蛋白）再包被一次，以封閉（blocking）固相上的空余間隙。另外，在檢測過程中標本須先行稀釋（1:40～1:200），以避免過高的陰性本底影響結果的判斷。 4．競爭法測抗體 當抗原材料中的干擾物質不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。其原理為樣本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結合。樣本中抗體量越多，結合在固相上的酶標抗體越少，因此陽性反應呈色淺于陰性反應。如抗原為高純度的，可直接包被固相。如抗原中會有干擾物質，直接包被不易成功，可采用捕獲包被法，即先包被與固相抗原相應的抗體，然后加入抗原，形成固相抗原。洗滌除去抗原中的雜質，然后與固相抗原競爭結合。另一種模式為將樣本與抗原一起加入到固相抗體中進行競爭結合，洗滌后再加入酶標抗體，與結合在固相上的抗原反應，如下圖所示。 5．競爭法測抗原 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以采用競爭法模式。其原理是樣本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結合。樣本中抗原量含量越多，結合在固相上的酶標抗原越少，最后的顯色也越淺。 小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法。 BIOBASE全自動酶免工作站是進行以上試驗必不可少的全自動檢驗設備。全程無需人工操作，實現全自動化試驗操作，大大提高操作準確度和安全性，山東博科為您的健康全程保駕護航！
